フリー走行2回目は気温23度、路面温度43度と、フリー走行1回目に比べて特に路面温度が大幅に上昇した。

　セッション開始間もなく、トップに立ったのはマルケスだったが、そのタイムをアンドレア・ドヴィツィオーゾ（ドゥカティ・チーム）、アンドレア・イアンノーネ（アプリリア・レーシング・チーム・グレシーニ）などが更新する。

　セッション残り時間10分を切るころ、ビニャーレスが3番手タイムをマーク。この時点で、マルケスは4番手、クアルタラロは6番手につけていた。

　最後のアタックが始まると、ビニャーレスが1分32秒638をたたき出してトップに浮上。クアルタラロが0.180秒差のタイムで迫るも、ビニャーレスのタイムに届かない。ビニャーレスはそのままこのセッションを制し、初日を総合トップで終えた。

　2番手にはフリー走行1回目トップのクアルタラロ。フリー走行1回目のワン・ツーがその順位を入れ替える形となり、ヤマハがワン・ツーを占めた。3番手にラストアタックでタイムを縮めたペトルッチがつけ、4番手にはドヴィツィオーゾ、5番手にリンスが続いた。

　6番手はアプリリア・レーシング・チーム・グレシーニのアンドレア・イアンノーネ。マルケスは7番手で、ホンダ最上位もマルケスだった。中上は16番手で初日を終えている。

　フリー走行1回目で転倒したロレンソは検査のため、アッセン市内の病院に搬送。ロレンソが胸と脊髄の痛みを訴えたため、脊髄のMRIと胸部から腹部にかけてCTスキャンによる検査が実施され、第6胸椎の骨折が確認された。ロレンソはこの負傷により、オランダGPを欠場することが発表されている。

　また、Moto2クラスのフリー走行1回目では、ディマス・エッキー・プラタマ（IDEMITSU Honda Team Asia）がセッション序盤に激しいクラッシュを喫してメディアセンターに運ばた。同セッションはこの転倒により赤旗が提示され、約20分にわたり中断。オランダGPの初日は深刻な転倒が相次ぐ形となった。